· 通过研究进化起源，科学家在真核生物中发现了“基因魔剪”CRISPR系统的“远房表亲”，有望实现更有效、精准的基因编辑。
·源于细菌的初代基因编辑疗法，对人体具有自身免疫不良反应的潜在风险。而源于真核生物的新型基因编辑工具，理论上更加安全，未来或可成为CRISPR系统有力的替代性选择。
Fanzor 蛋白（灰色、黄色、浅蓝色和粉色）与引导RNA（紫色）复合物及其靶标DNA（红色和蓝色）的冷冻电镜结构图。引导RNA用于指导Fanzor 蛋白对靶标DNA的基因编辑，其中红色为DNA双链中的目标链，蓝色为非目标链。图片来源：张锋实验室
在细菌免疫系统中发现的“基因魔剪”CRISPR-Cas9，成就了两位女性诺贝尔奖得主，由此开发的首个基因编辑疗法有望在今年获批上市。多年来，科学界涌现了一股在大自然中寻找类似Cas9的核酸酶的“淘金热”，希望打造出更为锐利和精准的基因编辑器，治疗各种基因病。
如今，华裔基因编辑技术先驱张锋朝这个目标又跨出了重要一步。来自美国麻省理工-哈佛博德研究所及麻省理工学院麦戈文脑研究所的张锋团队，首次在真核生物（藻类、真菌、植物和某些软体动物）中发现了一种名为Fanzor的蛋白质，它和同属CRISPR系统的Cas12酶拥有共同进化起源。经过系统工程改造优化后，未来Fanzor有望应用于新一代基因编辑器中。
相关论文于当地时间6月28日发表于顶级科学期刊《自然》（Nature）杂志。“这是研究生物多样性力量的又一个例子，可能还有更多有趣和潜在有用的（基因编辑）系统等待被发现和利用。”张锋对行业媒体Endpoints表示。
“这项研究最大的亮点是在真核生物中发现了RNA引导的基因编辑系统，因为和细菌等原核生物相比，在物种进化上真核生物离人类更近。”上海科技大学生命科学与技术学院教授、基因编辑中心主任陈佳告诉澎湃科技记者，由于之前发现的CRISPR系统主要来源于细菌并且往往是病菌，因此人体内可能已经存在Cas9蛋白的抗体，利用CRISPR-Cas9进行基因治疗时，或许会引起一些不必要的免疫反应，造成不良的治疗后果。
“基于Fanzor开发的新型基因编辑工具，将会为这类患者提供新的选择，减少基因治疗过程中的潜在风险。”陈佳补充道，目前基因编辑疗法的临床应用刚刚起步，主要针对严重威胁生命健康的单基因遗传病等展开，临床试验招募的患者人数并不多，因此自身免疫不良反应方面的隐患可能尚未展现。
仍需优化，提高基因编辑有效性和安全性
CRISPR是最早在大肠杆菌的基因体中发现的一段规律性序列，后来被证明是细菌免疫系统机制。细菌遭到病毒攻击后，会挑选病毒的一段DNA碎片插入自己的CRISPR序列，并生成互补的引导RNA。在病毒下次入侵时，细菌体内的Cas9活性酶就可以快速识别病毒DNA并将其切割摧毁。
基于这一原理，改造后的CRISPR-Cas9系统可以识别和切割与引导RNA互补的DNA序列，通过DNA修复机制进行基因编辑、插入或敲除。
2021年，通过重建CRISPR-Cas9系统的进化起源，张峰团队发现了三种可编程RNA引导的核酸酶，其中TnpB可能是CRISPR-Cas12的祖先，推测TnpB也具备RNA引导的核酸酶活性。
张锋团队的最新研究表明，TnpB也可能是Fanzor蛋白的祖先。研究者测试了四种Fanzor酶与引导RNA配对的复合物，其中三种可以实现对目标DNA序列的编辑，编辑效率最高达到11.8%，与早期版本的CRISPR基因编辑系统相当。
研究者选择了土壤里的真菌Spizellomyces punctatus中的Fanzor酶（SpuFz）作进一步优化，确定了三个可以改进其基因编辑效率的突变，使其对一种目标DNA序列实现了18.4%的编辑效率（大多数测试的靶标编辑效率约为10%～15%）。在引入这一系列突变后，Fanzor酶活性提高了10倍。
“我们仍然需要进一步设计这种酶，让它比得上Cas9酶基因编辑效率的金标准。”张锋谈道，SpuFz的其中一个独特优势在于，它不像Cas12蛋白具有旁切活性（collateral activity），因此可以实现更有针对性的基因编辑。
旁切活性是基因编辑常被诟病的“脱靶效应”的可能机制之一。即核酸酶在RNA引导下切割DNA的同时，还会降解目标位点附近的DNA，可能导致非预期的DNA双链断裂，乃至引发细胞凋亡或癌变。
“这篇文章并没有直接检测Fanzor系统基因编辑的脱靶情况，我认为这种可能性仍然存在。”陈佳向澎湃科技记者介绍，目前针对Cas酶的大量优化工作，已经可以很好地降低其在脱靶位点的编辑效率，相信同样的策略也可以应用在Fanzor系统开发上。
张锋首次将CRISPR-Cas9应用于哺乳动物基因组编辑，获得了关键专利，但与诺贝尔奖失之交臂。2020年，诺贝尔化学奖授予另两位基因编辑研究先驱詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna，图右）与埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）。图片来源：Bloomberg
新型“迷你”基因编辑器，更易递送入人体
在2021年的研究中，除了TnpB，张锋团队发现的可编程RNA引导的核酸酶还有IscB和IsrB。其随后的研究表明，尺寸更小的IsrB很可能是IscB的前身，而IscB正是Cas9的祖先。
在IscB发现后不到两年时间，经过对其大量优化和改造，中科院神经所研究员杨辉团队开发出了两个“迷你型”碱基编辑器，在真核细胞中的单碱基编辑效率最高可达92%。文章于今年5月25日发表于科学期刊《自然-方法》（Nature Methods）。
碱基编辑器是新一代基因编辑工具，又被称作“基因铅笔”，可以在不产生DNA双链断裂的情况下，定向“擦除”和“重写”基因组的单个碱基，因此也被认为有更好的安全性。
“新的此类核酸酶的挖掘，可以进一步扩展底层平台性技术，构建新型碱基编辑器、先导编辑器等。”陈佳指出，Fanzor同样也可用于新型基因编辑器开发，预期可能在近年内实现。
和IscB一样，尺寸较小也是Fanzor的另一优势。这类酶约含400～700个氨基酸，平均算来仅有常用Cas9酶的四成大小。目前常用的腺病毒载体有容量限制，越小的基因编辑器，越容易被递送到人体内。
不过，在最近接受Endpoints的采访中，张锋表示，围绕各类Fanzor蛋白组建新公司“还为时过早”。
公开资料显示，张锋至少已经成立了8家生物技术公司，涵盖传统CRISPR基因编辑、碱基编辑疗法开发、基于CRISPR的分子诊断、新型基因工具开发等多个方向。首家成立的公司Editas Medicine持有CRISPR关键专利，但基因编辑相关项目的临床试验结果和开发进度落后于两位诺奖得主创办的公司。（详见澎湃科技报道：《基因编辑明星公司首个临床试验折戟，初代“基因魔剪”不被看好》）
“和其他新发现的核酸酶一样，Fanzor距离临床治疗还有一段距离，需要提高编辑效率和系统稳定性、解决递送问题等。”陈佳介绍，目前进入临床的仍然只有基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑疗法，因为它发现得最早，全球诸多科学家集中大量精力和资源对其进行研究和改造，相对最为成熟。
打开基因编辑工具的天然“宝库”
此外，陈佳还指出，在技术开发的角度外，张锋团队的这篇论文发现的这类新现象，提出了一个有意思的科学问题，值得科学界深入探索，“CRISPR系统在细菌体内发挥免疫功能，而真核生物有另外的防御系统，那么Fanzor蛋白在真核生物中天然的生理功能是什么？这篇文章没有完全揭示，而是在‘讨论’部分说有待研究。” 在他看来，Fanzor蛋白未知的生理功能对人体有危害的概率不大。
Fanzor 、CRISPR系统中的Cas12与两者的共同祖先TnpB的结构对比。张锋团队论文指出，Fanzor的生理作用仍然未知，有待研究。图片来源：论文截图
此前，张锋团队将IscB、IsrB、TnpB命名为OMEGA家族，它们都由微生物基因组中的转座子编码。转座子是一种遗传元素，又被称为“跳跃基因”，可以跨物种转移，在基因组内移动并自行复制粘贴，对于促进生物多样性和适应性发挥着重要作用。系统发育分析表明，Fanzor基因的直系祖先正是通过这种水平基因转移机制（有别于亲子代间的垂直遗传），从细菌“跳跃”到了真核生物中。
张锋过去的学生奥马尔·阿布达耶（Omar Abudayyeh）和乔纳森·古腾伯格 （Jonathan Gootenberg）目前和张锋在麦戈文脑研究所共用一个实验室。两周前，他们在预印本网站bioRxiv上发布了他们关于Fanzor类蛋白基因编辑能力的研究，该论文正在科学期刊审稿过程中等候发表。
他们的工作主要集中于在真核生物中寻找不同的 Fanzor 蛋白并分类。他们将这些蛋白共同命名为 HERMES家族。目前看来，它们显示出的基因编辑效率还低于张锋发表的研究。阿布达耶在个人推特主页上介绍，研究绘制了从TnpB到HERMES的进化路径，发现HERMES已经进化出高密度的内含子和核入侵信号（NLS）序列，表明它在真核生物中经历了广泛和长期的适应性进化，可能获得了新的功能。
“虽然HERMES可能在指导真核生物转座子在基因组中的位移方面发挥作用，类似于TnpB蛋白，但这种作用的确切性质仍然未知。我们对研究HERMES在真核生物中功能的许多新方向感到兴奋，并将其作为潜在（基因编辑）工具进行工程设计。”阿布达耶表示。
康奈尔大学华裔研究员柯爱龙（Ailong Ke）在接受Endpoints采访时亦表示，张锋团队的最新研究“令人兴奋”且“异常优雅”。他认为，源自真核生物的基因编辑系统可能已经进化到在大型和复杂的基因组中工作良好，理论上说，“对于真核基因编辑，它们可能更有效甚至更精确。”
“HERMES核酸酶在不同真核生物谱系及其相关病毒中的广泛分布表明，真核生物中可能存在更多未知的RNA引导系统，为未来表征和开发新生物技术提供了丰富的资源。”阿布达耶还写道。
参考文献：
1. https://www.nature.com/articles/s41586-023-06356-2
2. https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6856
3. https://www.nature.com/articles/s41592-023-01898-9
4. https://endpts.com/feng-zhangs-lab-unveils-new-fanzor-gene-editing-tool-made-from-eukaryotic-proteins/
